Les principes derrière les pinces magnétiques dans la recherche biologique

Les pinces magnétiques sont une technique de manipulation monomolécule qui utilise des champs magnétiques pour appliquer des forces contrôlées aux biomolécules comme l'ADN, l'ARN et les protéines. En attachant une perle superparamagnétique à la molécule d'intérêt et en la soumettant à un gradient de champ magnétique, les chercheurs peuvent s'étirer, tordre ou tenir la molécule avec précision piconewton, ce qui permet une étude détaillée de ses propriétés mécaniques et biophysiques.

Principe de travail de base : Force magnétique et couple

Le principe fondamental sous-jacent des pinces magnétiques est l'interaction entre une perle magnétique et un champ magnétique externe. Lorsqu'elle est placée dans un champ magnétique non uniforme, la perle éprouve une force proportionnelle au gradient du champ au carré et à la susceptibilité magnétique de la perle. La perle est typiquement superparamagnétique, ce qui signifie qu'elle n'acquiert de magnétisation qu'en présence d'un champ externe, évitant l'agrégation. F peut être approché par:

F = V·(χ·ΔB2) / (2·μ0)

où V est le volume de perles, χ est la susceptibilité magnétique, B est la densité du flux magnétique, et μ0 En contrôlant la position magnétique ou le courant dans les électroaimants, les chercheurs peuvent générer des forces de femtonewtons à des centaines de picolewtons.

Torque magnétique et contrôle de rotation

En plus de la force linéaire, les pinces magnétiques peuvent appliquer le couple en tournant le champ magnétique. Cela permet aux chercheurs de tordre l'ADN ou d'autres polymères, en étudiant le supercoilling et l'activité des topoisomérases. τ sur une perle avec aimantation M dans un domaine B est donné par τ = M × B. En tournant précisément les aimants, on peut faire tourner la perle, en exerçant un couple connu sur la molécule attachée. Cette capacité est unique aux pinces magnétiques et est essentielle pour comprendre la mécanique de l'organisation chromosomique et de la réplication de l'ADN.

Composantes clés et configuration expérimentale

  • Perles magnétiques: On utilise couramment des perles superparamagnétiques (par exemple, des Dynabeads) de diamètre compris entre 0,5 et 4,5 μm, enrobées de streptavidin ou d'anticorps, pour permettre un attachement spécifique aux molécules biotinylées ou marquées par des antigènes.
  • Source du champ magnétique : Les aimants néodyme permanents montés sur des étages motorisés ou des bobines électromagnétiques fournissent le gradient de champ. Les électroaimants permettent une modulation de champ rapide mais génèrent de la chaleur; les aimants permanents offrent stabilité et simplicité.
  • Chambre d'échantillonnage : Une cellule à flux avec un couvercle au microscope et une lame de verre, souvent fonctionnelle avec une couche de passivation (p. ex., PEG, BSA) pour réduire la liaison non spécifique. La molécule d'intérêt est fixée entre une perle et la surface.
  • Système d'imagerie: Un microscope optique inversé avec un objectif à haute ARN et une caméra CCD ou CMOS trace la position de la perle à ~30 Hz à 1 kHz par microscopie vidéo. La position de la perle en trois dimensions est déterminée à partir de son motif de diffraction.
  • Stade Piezo: Une étape de nanoposition maintient la focalisation et peut déplacer l'échantillon par rapport aux aimants pour un étalonnage précis de la force.

Des protocoles détaillés pour la construction d'une pince magnétique d'une pince magnétique d'une installation magnétique sont disponibles à partir de la Laboratoire Neuman au NIH (examen 2016) et de la open-source 'Magnetic Tweezer Kit' par le laboratoire Strick- Oui.

Étalonnage de force dans les pinces magnétiques

La détermination précise de la force est essentielle. Mouvement brownien Dans un potentiel harmonique, le perle fluctue autour de sa position d'équilibre. k--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- est liée à la variance du déplacement de la perle: k--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- = kBT / -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------. La force F est alors F = k---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------·L, où L L'étalonnage nécessite également la mesure de la géométrie du champ magnétique et de son gradient, souvent à l'aide d'une sonde Hall ou en tirant sur une molécule de référence connue (par exemple, une épingle à cheveux ADN).

Portée de la force et résolution

Les pinces magnétiques commerciales produisent généralement des forces allant de 0,1 pN à 100 pN avec une résolution d'environ 0,1 pN. Les pinces électroaimants sur mesure peuvent atteindre jusqu'à 300 pN. La résolution spatiale dans la direction z est généralement de 1–2 nm, permettant la détection d'étapes à simple paire dans les translocases ADN.

Applications en recherche biologique

Des pinces magnétiques ont été utilisées pour étudier une large gamme de processus biomoléculaires. Ci-dessous sont les domaines d'application clés avec des exemples récents:

Mécanique de l'ADN et superplafond

En resserrant une molécule d'ADN entre une perle magnétique et une surface, les chercheurs peuvent mesurer son extension en fonction de la force, donnant les paramètres du modèle de chaîne de vers (WLC). La rotation de l'aimant introduit des supercoils, permettant d'étudier l'activité des topoisomérases et des gyrases. Étude de Phillips et coll., 2023, Nature Les auteurs ont utilisé des pinces magnétiques pour montrer comment le maintien structurel des complexes chromosomiques (SMC) lie l'ADN en temps réel.

Interactions protéines-ADN

Les pinces magnétiques permettent l'observation en temps réel des protéines liant l'ADN, y compris les hélicases, les polymérases et les remodeleurs nucléosomiques. En surveillant les changements de longueur de l'attache, les chercheurs peuvent suivre la vitesse de translocation, la taille des étapes et l'arrêt des enzymes. Abbondanzieri et al. 2005 papier en Sciences) .

RNA Pliage et ribozymes

Les molécules d'ARN se replient en structures tertiaires complexes qui peuvent être dépliées mécaniquement par des pinces magnétiques. Les courbes force-extension fournissent des paramètres thermodynamiques et cinétiques de pliage. Des travaux récents ont élucidé le paysage pliant de la ribozyme de la épingle à cheveux et l'effet des ions Mg2+ sur la stabilité.

Mécanobiologie cellulaire

Des pinces magnétiques sont également appliquées aux cellules vivantes. Les perles attachées aux récepteurs de surface cellulaire (par exemple, les intégrines, les cadhérines) permettent d'étudier la mécanisation cellulaire et la signalisation dépendante de la force. Étude 2020 Cellule où les pinces magnétiques ont révélé que l'activation de la kinase d'adhérence focale (FAK) dépend de la force mécanique et de la durée.

Avantages sur d'autres techniques monomolécules

  • Pas de photodommage: Contrairement aux pinces optiques, les pinces magnétiques n'utilisent pas de lasers à haute intensité, permettant des mesures à long terme (heures) sans endommager l'échantillon biologique.
  • Parallélisation : De nombreuses perles peuvent être suivies simultanément dans le même champ de vision, augmentant considérablement le débit. Des centaines de molécules peuvent être testées dans une seule expérience.
  • Force stable: La force d'un aimant permanent est extrêmement stable au fil du temps, avec une dérive de 1 à 2 ordres de grandeur inférieure à la pince optique.
  • Contrôle du couple: La capacité d'appliquer la rotation et le couple de mesure est unique aux pinces magnétiques et essentielle pour étudier les processus de supercoilling et de torsion de l'ADN.
  • Facilité d'échange de tampons: La chambre à flux ouvert permet de changer les solutions sans affecter de façon considérable la mesure, permettant des études de cinétique enzymatique dans diverses conditions.

Limites et défis pratiques

Malgré leurs avantages, les pinces magnétiques ont des limites :

  • Portée limitée de la force: Les réglages permanents d'aimant atteignent généralement 100 pN, moins que les pinces optiques (qui peuvent dépasser 500 pN).Les variantes d'électroaimant peuvent aller plus haut mais souffrent d'inhomogénéités de chauffage et de champ.
  • Pas de piégeage en trois dimensions: La perle n'est pas piégée dans un puits potentiel; elle est fixée à la surface, ce qui limite les expériences aux molécules fixées à la surface et ne peut mesurer les espèces qui en sont librement diffusées.
  • Taille et hétérogénéité des perles: Différentes perles ont des moments magnétiques variables, nécessitant un calibrage individuel pour chaque perle, ce qui prend du temps.
  • Dérivés en z-direction: Malgré des forces latérales stables, la dérive verticale causée par les fluctuations de température et le fluage mécanique peut limiter la résolution.

Progrès techniques récents

Au cours de la dernière décennie, les pinces magnétiques ont connu des améliorations significatives :

  • Systèmes d'électroaimants miniaturisés: Les bobines microfabriquées permettent un changement et une intégration plus rapides dans les dispositifs microfluidiques, ce qui permet des expériences à haut débit.
  • Pinces à rétroaction contrôlée : En utilisant une boucle PID sur la position de la perle, les chercheurs peuvent maintenir une force constante ou une extension constante, ouvrant les études des changements conformationnels dépendants de la force.
  • Fluorescence combinée et pinces magnétiques: L'intégration avec la microscopie TIRF ou confocale permet une lecture simultanée optique et mécanique, par exemple, le suivi des protéines fluorescentes marquées sur l'ADN étiré.
  • Apprentissage automatique pour le suivi des perles: Les algorithmes d'apprentissage profond améliorent la résolution spatiale et peuvent automatiquement corriger les non-linéarités dans le champ magnétique.

Pour un aperçu complet des faits nouveaux, voir l'examen par Neuman et ses collègues de travail Revue annuelle de biophysique (2022)- Oui.

Orientations futures et défis à relever

Le champ s'oriente vers l'intégration de pinces magnétiques à d'autres modalités, par exemple, en les combinant avec la détection des nanopores à la séquence en appliquant la force, ou avec la microscopie de force atomique (AFM) pour cartographier simultanément la topographie et la mécanique. in vivo L'application de pinces magnétiques à l'intérieur des animaux vivants, en utilisant des approches peu invasives. Le développement d'aimants permanents plus petits et plus forts (comme la haute coercivité NdFeB) et une meilleure fonctionnalisation de la surface des perles continueront de pousser la résolution et la portée de la force.

Conclusion

Les pinces magnétiques constituent un outil polyvalent et de haute précision pour l'étude des propriétés mécaniques des biomolécules et de leurs interactions. Leur capacité à appliquer la force et le couple, combinée à une longue stabilité et à une parallélisation, les rend uniques pour étudier la topologie de l'ADN, la dynamique des protéines-ADN et la mécanisation cellulaire.