Fundamentos de la espectroscopia UV-Vis

El espectro electromagnético y la absorción molecular

La espectroscopia ultravioleta-visible (UV-Vis) es una técnica analítica de piedra angular que pronostica la estructura electrónica de moléculas midiendo cómo absorben la luz en las regiones ultravioletas y visibles del espectro electromagnético. La técnica suele abarcar longitudes de onda de aproximadamente 190 nm en el ultravioleta profundo a 800 nm en la foto infrarroja. E = hc/λ, donde h es constante de Planck (6.626 × 10−34 J·s), c es la velocidad de la luz (2.998 × 108 m/s), y λ es la longitud de onda. Por lo tanto, longitudes de onda más cortas corresponden a transiciones de mayor energía, y la diferencia de energía entre el suelo y estados excitados debe exactamente igualar la energía foton para la absorción que se produzca. Esta naturaleza cuantitativa de absorción da lugar a picos característicos en el espectro, cada uno correspondiente a una transición electrónica específica dentro de la molécula.

La Ley de Beer-Lambert

La base cuantitativa de la espectroscopia UV-Vis es la ley Beer-Lambert, que relaciona la absorción (A) de una muestra a su concentración (c) y longitud de la ruta (l): A = ε · c · lSin embargo, la concentración de la radiación no se conoce como un detector de absorción de la muestra, una característica única de cada molécula en una determinada longitud de onda. La absorción de la radiación de la radiación de la radiación de la serie es una medida de lo fuerte que un compuesto absorbe la luz en una longitud de onda determinada y puede variar de menos de 100 L·mol−1cm-1 para la transición de más de 100.000 L·mol-1

Componentes y configuraciones de instrumentos

Un espectrofotómetro UV-Vis típico consiste en cuatro componentes principales que trabajan en concierto:

  • Fuente de luz: Las lámparas de deuterio proporcionan una emisión continua en la región UV (190–400 nm), mientras que las lámparas de tungsteno-halógeno cubren la región visible y cercana a la infrarroja (320–2500 nm). Los instrumentos modernos a menudo combinan ambas fuentes para una cobertura sin costuras en toda la gama UV-Vis. Las lámparas de arco Xenon también se utilizan en algunos instrumentos para su alta intensidad a través de una amplia gama.
  • Monocromo: Utiliza un gratificante de difracción o prisma para dispersar la luz de espectro ancho en sus longitudes de onda componentes y seleccionar una banda estrecha de longitudes de onda. El ancho de banda (ancho de abertura de espectro) determina la resolución del instrumento; valores típicos rango de 0,5 nm a 5 nm. Un ancho de corte más estrecho proporciona una mejor resolución, pero reduce la cantidad de luz que llega al detector, aumentando el ruido.
  • Compartimento de muestra: Sostenga la muestra en una cuveta (titicamente cuarzo para mediciones UV por debajo de 350 nm, ya que el vidrio y el plástico absorben fuertemente en la región UV; cuvettes de vidrio o plástico desechables son aceptables para mediciones de rango visible solamente).La longitud de ruta de las cuvettes estándar es generalmente de 1 cm, aunque la longitud de ruta variable y las microcuvettes están disponibles para aplicaciones especializadas.
  • Detector: Los tubos fotomultiplier (PMT) ofrecen alta sensibilidad y bajo ruido, pero son detectores de un solo canal que requieren escaneado. arrays de fotodiode (PDAs) y dispositivos de coupled de carga (CCDs) permiten la detección simultánea de múltiples longitudes de onda, permitiendo la adquisición rápida espectral.

Existen dos configuraciones principales de instrumentos. Instrumentos de haz único mide la intensidad de la luz que pasa a través de la muestra y requiere una medición de base separada con un blanco. Instrumentos de doble haz dividir la luz en vigas de muestra y referencia usando un cortamanos o separador de haz, comparando continuamente las dos señales para compensar las fluctuaciones de intensidad de fuente, absorción de solventes y efectos atmosféricos. Este diseño produce espectros más precisos con mejor estabilidad de base y es la configuración preferida para la mayoría de las aplicaciones analíticas. Más recientes avances incluyen sondas de fibra óptica para lectores de detección remota y microplatos para el análisis de 384 de alta velocidad de 96 placas

Adquisición de un espectro UV-Vis

El proceso de adquisición de un espectro UV-Vis comienza con una medición de base utilizando una solución en blanco (el solvente o matriz sin el analyte) para corregir la absorción de fondo de la cuveta, solvente y óptica de instrumentos. La muestra se coloca en el camino de luz, y la absorción se registra como una función de longitud de onda. El espectro resultante muestra bandas de absorción en longitudes de onda específicas, con la intensidad de la banda (superficiencia de detección de la superficie de la proporción

Transiciones electrónicas en Molecules

Las transiciones electrónicas implican la promoción de un electrón desde una órbita de unión o no unión a un orbital antibón. El tipo de transición determina la longitud de onda, intensidad y forma de la banda de absorción. La energía necesaria para una transición depende de la brecha energética entre la órbita molecular más alta ocupada (HOMO) y la onda molecular más baja no ocupada (LUMO).

σ → σ* Transiciones

Estos instrumentos de esmerilado UV son muy altos, normalmente ocurren en la región de vacío UV por debajo de 190 nm, que está más allá de la gama de instrumentos estándar UV-Vis. Son comunes en hidrocarburos saturados como metano, etano y cicloohexano, donde todos los electrones de valencia están involucrados en la unión de sigma. Por ejemplo, los bonos C-C y C–H σ absorben sólo en las ondas son muy cortas

n → σ* Transiciones

Identificar las moléculas que contienen heteroatom con electrones de pares solitarios no alineados (por ejemplo, oxígeno, nitrógeno, sulfuro, halógenos). Estas transiciones aparecen en la región UV entre 150 y 250 nm y son generalmente débiles, con absorptividades molares típicamente inferiores a 500 L·mol-1cm−1.

π → π* Transiciones

Este sistema de absorción de π es muy importante para el análisis UV-Vis porque se producen en las regiones fácilmente accesibles y visibles y son generalmente intensos (aborptividades moderadas a menudo superan los 10.000 L·mol−1·cm−1). Estas transiciones se producen en moléculas que contienen enlaces no saturados, como alkenes (C=C), carbonyls (C=O), y anillos aromáticos.

n → π* Transiciones

Estos incluyen la promoción de un electron no alineado (sino de Sol) a un π* antibón orbital. Son características de los grupos de carbono (C=O), grupos nitro (NO2), y otros grupos funcionales que contienen tanto un vínculo π y un heteroatom con electrones de par solitario. n → π* transiciones son mucho más débiles que π → π* transiciones

Transiciones de carga-transferencia

Los complejos de carga-transferencia, un electrón se transfiere de una órbita donante a un receptor orbital, ya sea dentro de la misma molécula (transferencia de carga intramolecular) o entre dos moléculas diferentes (transferencia de carga intermolecular). Estas transiciones son a menudo muy intensas, con absorpciones molares superiores a 10.000 L·mol-1·cm−1, y pueden aparecer en la región visible, dando lugar

d-d Transitions (Ligand Field Transitions)

Los iones de metal transicional (por ejemplo, Cu2+, Fe3+, Co2+, Ni2+) en los complejos de coordinación presentan transiciones d-d débiles en la región visible y cercana a UV debido a la división de d-orbitales por el campo ligando según la teoría del campo de cristal. Estas transiciones son Laporte-forbidden (paridad-forbidden) y por lo tanto tienen baja < Br⁻ < Cl⁻ < F⁻ < OH⁻ < H₂O < NH₃ < ethylenediamine < NO₂⁻ < CN⁻ < CO.

Factores que afectan a la absorción UV-Vis

Conjugación y cromoforos

A medida que aumenta la conjugación, la brecha energética entre el HOMO y el LUMO disminuye, desplazando la absorción a longitudes de onda más largas (roque matemático o rojo) y a menudo aumentando la intensidad de absorción (efecto hipercromo). Por eso el benceno (un anillo aromático con tres anillos dobles conjugados) absorbe a 254 nm, naphthalene (dos anillos fusionados) absorbe a onda más largos cromoforo es cualquier grupo funcional responsable de la absorción en la región UV o visible. Cromoforos comunes incluyen C=C (alkenes), C=O (carbonyls), NO2 (nitro), N=N (azo), y anillos aromáticos. Las reglas Woodward-Fieser proporcionan pautas empíricas para predecir el máximo de absorción de los dienes y enones conjugados basados en características estructurales como el número de dobles de los enlaces conjugados, anillos Auxocromas son grupos que no absorben en la región UV-Vis pero pueden cambiar (bathochromic o hypsochromic) y/o intensificar (hipercromía) la absorción de un cromoforo al que se adjuntan. Los auxocromos comunes incluyen –OH, –NH2, –Cl, –Br y –OCH3.

El efecto de los auxocromos se atribuye a su capacidad de extender la conjugación.

Efectos Solvent

El sistema de control de ondas de agua se puede estabilizar en forma significativa por el estado de disolvente.El sistema de control de ondas de agua de alta calidad se puede estabilizar en el estado de disolventes.

pH y efectos sustitutivos

Los cambios en la estructura de pH pueden protonar o desprotonar grupos funcionales, alterando su estructura electrónica y por lo tanto su espectro de absorción. Por ejemplo, el espectro de absorción de los cambios de fenol significativamente en la solución básica debido a la formación del ión de fenodo, que tiene un par de lona adicional que extiende la conjugación en el anillo aromático, resultando en un cambio de baño cromo y efecto hipercromo.

Temperatura y concentración

En concentraciones altas, pueden producirse interacciones moleculares como la dimerización, la agregación o la formación compleja, provocando desviaciones de la ley Beer-Lambert y alterando el espectro de absorción. Por ejemplo, el espectro de absorción de los cambios azules metileno significativamente en la descifración a altas concentraciones. Los cambios de temperatura pueden afectar la unión de hidrógeno, la equilibria conformacional y la población de estados vibratorios, alterando sutilmente los espectros de absorción.

Técnicas avanzadas y análisis de datos

Espectroscopia derivativa

La espectroscopía derivativa implica calcular el primer, segundo o superior derivado del espectro de absorción respecto a longitud de onda. Espectra derivativo puede resolver bandas de absorción superpuestas, eliminar deriva de referencia debido a la dispersión de luz, y mejorar características espectrales sutiles que no son aparentes en el espectro original. Por ejemplo, el segundo espectro derivativo muestra picos negativos en las posiciones de absorción maxima y puede resolver bandas de análisis de cerca

Diferencia Espectroscopia

La espectroscopia de diferencia mide el cambio de absorción entre dos muestras o entre una muestra y una referencia en diferentes condiciones (por ejemplo, antes y después de una reacción química, a diferentes valores de pH, o en presencia y ausencia de un ligand).Esta técnica es ampliamente utilizada en la bioquímica para estudiar la unión de proteínas-ligand, la kinetica de enzimas y los cambios de conformación.

Titraciones espectrofotométricas

Al monitorizar la absorción en una o más longitudes de onda como función de adición titrant, los investigadores pueden determinar constantes de equilibrio, estequiometrías y valores pKa. La titración espectrofotométrica es más sensible que la titración potenciométrica para especies de absorción débil o colorida y puede ser utilizado para compuestos que carecen de una respuesta electrode adecuada.

Aplicaciones de la espectroscopia UV-Vis

La espectroscopia UV-Vis es una de las técnicas analíticas más utilizadas en las disciplinas científicas. A continuación se presentan aplicaciones clave con ejemplos representativos:

Quantitativo Análisis

El uso más común es determinar la concentración de un compuesto conocido en solución. Utilizando una curva de calibración de absorción versus concentración construidas a partir de soluciones estándar, las muestras desconocidas se cuantifican fácilmente. Esto se aplica ampliamente en los ensayos farmacéuticos (por ejemplo, determinando la concentración de ingredientes farmacéuticos activos), pruebas de calidad del agua (por ejemplo, nitrato, contenido de fosfato y análisis de amoníaco utilizando métodos colorimétricos), abstricía alimentaria (euro).

Kinetics and Reaction Monitoring

Mediante la medición de la absorción en una longitud de onda fija con el tiempo, los investigadores pueden seguir el progreso de una reacción química en tiempo real. Por ejemplo, la tasa de reacciones enzimáticas puede ser monitoreada siguiendo la apariencia o desaparición de un sustrato o producto cromofórico. En el ensayo clásico para la fosfata alcalina, la hidrolisis del fosfato de p-nitrofenilo corto

Identificación de los grupos funcionales y elucidación estructural

La presencia y la posición de los picos de absorción pueden indicar cromofores específicos y proporcionar información sobre la estructura molecular. Por ejemplo, una fuerte absorción de 250–300 nm suele sugerir un anillo aromático o sistema conjugado, mientras que una absorción débil de 270–350 nm puede indicar la presencia de un grupo de carbono (n → π* transición).

Análisis bioquímico y biomédico

La espectroscopía UV-Vis es indispensable para cuantificar biomoléculas. Las proteínas se cuantifican midiendo la absorción en 280 nm, que surge de los aminoácidos aromáticos triptófanos y tirosina. Los ácidos nucléicos (DNA y RNA) se cuantifican en 260 nm, y la relación A260/A280 es un control de pureza estándar (ADNúmero puro:

Ciencia y Nanotecnología del Material

La espectroscopia UV-Vis es una herramienta primaria para caracterizar las propiedades ópticas de los nanomateriales. La resonancia de plasmón superficial (SPR) de las nanopartículas de oro y plata da lugar a bandas de absorción intensas en la región visible, con la longitud de onda pico dependiendo del tamaño de partículas, forma, entorno dieléctrico, y estado de agregación.

Environmental Monitoring

Espectrómetro UV-Viscópico se emplea para detectar y cuantificar contaminantes en muestras ambientales. Los hidrocarburos aromáticos (por ejemplo, benceno, tolueno, naftalina) absorben fuertemente en la región UV y pueden ser detectados en muestras de agua y aire. Metales pesados como cobre, hierro y cromo pueden cuantificarse después de la complejidad con reactivos cromogénicos (epheneline).

Control de calidad industrial

En las industrias farmacéutica, química y alimentaria, la espectroscopia UV-Vis se utiliza para el control de calidad rutinaria de materias primas, intermediarios y productos acabados. Se utiliza para verificar la identidad y pureza de compuestos, determinar la concentración de ingredientes activos y monitorear la estabilidad y degradación. La técnica es simple, rápida y rentable, lo que lo hace adecuado para el análisis de alto rendimiento en laboratorios de control de calidad.

Limitaciones y consideraciones

A pesar de su potencia y versatilidad, la espectroscopia UV-Vis tiene importantes limitaciones que deben ser consideradas al diseñar experimentos e interpretar datos. En primer lugar, la técnica sólo proporciona información sobre transiciones electrónicas y no puede proporcionar información estructural detallada comparable a la espectroscopia NMR o IR.

Conclusión

La técnica de absorción de rayos UV-Vis sigue siendo una técnica analítica esencial y ampliamente utilizada para estudiar transiciones electrónicas en moléculas. Su simplicidad, velocidad, bajo costo y amplia aplicabilidad lo convierten en una técnica de primera línea en química, bioquímica, ciencia de materiales, análisis ambiental y control de calidad industrial.

Lectura y recursos adicionales